DNA 標記方案——點擊寡核苷酸和 DNA 的化學標記

點擊化學是一種多功能反應，可用於(yu) 合成各種綴合物。事實上，任何生物分子都可以使用點擊化學方法輕鬆地用小分子標記，例如熒光染料、生物素等。

點擊化學反應發生在兩(liang) 種組分之間： 疊氮化物和炔烴（末端乙炔）。疊氮基和炔基在天然生物分子中幾乎從(cong) 未遇到過。因此，該反應具有高度生物正交性和特異性。如果需要標記寡 核苷酸，可以在許多定製寡核苷酸合成設施和公司訂購炔烴修飾的寡核苷酸。

1. 使用下表計算點擊化學標記所需的試劑體(ti) 積。準備所需的儲(chu) 備溶液（見附錄）。

   試劑	混合物中的最終濃度	原液濃度
   炔烴修飾寡核苷酸	變化（20 — 200 uM）	各不相同
   疊氮化物	1.5 x（寡核苷酸濃度）	10 mM DMSO 溶液
   二甲基亞碸	50體積％	—
   抗壞血酸	0.5毫米	5 mM 水中
   銅-TBTA絡合物	0.5毫米	10 mM，溶於 55 vol% DMSO

2. 將炔烴修飾的寡核苷酸或 DNA溶解在耐壓小瓶中的水中。

3. 添加2M 醋酸三乙銨緩衝(chong) 液（pH 7.0）至終濃度 0.2 M。

4. 添加DMSO，並渦旋。

5. 添加疊氮化物儲(chu) 備溶液（DMSO 中的 10 mM），並渦旋。

6. 將所需體(ti) 積的 5mM 抗壞血酸儲(chu) 備溶液添加到混合物中，並短暫渦旋。

7. 通過向其中鼓泡惰性氣體(ti) 30 秒來對溶液進行脫氣。可以使用氮氣、氬氣或氦氣。

8. 將所需量的 10 mM 銅 (II)-TBTA 庫存在 55% DMSO 中添加到混合物中。用惰性氣體(ti) 衝(chong) 洗小瓶並蓋上蓋子。

9. 渦旋混合物。如果觀察到明顯的疊氮化物沉澱，則將小瓶在 80°C 下加熱 3 分鍾，然後渦旋。

10. 在室溫下保存過夜。

11. 用丙酮（對於(yu) 寡核苷酸）或乙醇（對於(yu) DNA）沉澱結合物。

    沉澱寡核苷酸綴合物：

    向混合物中添加至少 4 倍過量體(ti) 積的 3% 高氯酸鋰丙酮溶液（如果混合物體(ti) 積很大，則分成幾個(ge) 小瓶）。

    沉澱 DNA 綴合物：

    向混合物中添加乙酸鈉至終濃度0.3M；

    添加 2.5 體(ti) 積的乙醇（或 0.8 體(ti) 積的異丙醇）。

    充分混合並在-20°C下保持20分鍾。

12. 10000 rpm 離心 10 分鍾。

13. 丟(diu) 棄上清液。

14. 用丙酮 (1 mL) 洗滌沉澱，以 10000 rpm 離心 10 分鍾。

15. 棄去上清液，幹燥沉澱，並通過 RP-HPLC 或 PAGE 純化綴合物。