PEG多肽化學修飾介紹

多肽是由多個(ge) 氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物。它們(men) 在生物體(ti) 中普遍存在。迄今為(wei) 止，已在生物體(ti) 中發現了數千種多肽。多肽在生命活動中對各係統、器官、組織、細胞的功能活動發揮著重要的調節作用。常用於(yu) 功能分析、抗體(ti) 研究、藥物開發等領域。隨著生物技術和多肽合成技術的成熟，越來越多的多肽藥物被開發並應用於(yu) 臨(lin) 床。

多肽修飾有很多種，簡單分為(wei) 後修飾和過程修飾（利用衍生氨基酸）。根據修飾位點的不同，有N端修飾、C端修飾、側(ce) 鏈修飾、氨基酸修飾、骨架修飾等。作為(wei) 改變肽鏈主鏈結構或側(ce) 鏈基團的重要手段、肽修飾可以有效改變肽化合物的理化性質，增加水溶性，延長在體(ti) 內(nei) 的作用時間，改變其生物分布，消除免疫原性，減少毒副作用等。這裏主要介紹幾種主要的肽修飾策略和特點。

1.環化

環肽在生物醫學方麵有很多應用，許多具有生物活性的天然肽都是環肽。由於(yu) 環肽比線性肽剛性更強，因此對消化係統具有很強的抵抗力，能在消化道中存活，並且與(yu) 目標受體(ti) 有更強的親(qin) 和力。環化是合成環狀多肽最直接的方法，特別是對於(yu) 結構骨架較大的多肽。按環化方式可分為(wei) 側(ce) 鏈-側(ce) 鏈型、末端-側(ce) 鏈型、末端-末端型。

(1) 側鏈到側鏈

最常見的側(ce) 鏈-側(ce) 鏈環化類型是半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。最常見的側(ce) 鏈-側(ce) 鏈環化類型是半胱氨酸殘基之間的二硫鍵橋接。引入環化方法是通過將一對半胱氨酸殘基脫保護，然後氧化形成二硫鍵。它可以選擇性地除去巰基保護基團，從(cong) 而實現形成多個(ge) 環。環化可以在解離後在溶劑中進行，也可以在解離前在樹脂上進行。由於(yu) 樹脂上的肽不易形成環化構象，因此樹脂上的環化可能比溶劑中的環化效率低。

另一種類型的側(ce) 鏈-側(ce) 鏈環化是在天冬氨酸或穀氨酸殘基與(yu) 堿性氨基酸之間形成酰胺結構。它要求多肽的側(ce) 鏈保護無論是在樹脂上還是解離後的堿基都必須能夠選擇性去除。第三種側(ce) 鏈-側(ce) 鏈環化是通過酪氨酸或對羥基苯基甘氨酸形成二苯醚。天然產(chan) 物中的這種環化僅(jin) 存在於(yu) 微生物產(chan) 物中，環化產(chan) 物往往具有潛在的藥用價(jia) 值。這些化合物的製備需要的反應條件，因此它們(men) 不常用於(yu) 常規多肽的合成。

(2) 終端到側鏈

末端側(ce) 鏈環化通常涉及C末端和賴氨酸或鳥氨酸側(ce) 鏈的氨基，或者N末端和天冬氨酸或穀氨酸側(ce) 鏈。還有一些多肽環化是通過末端C與(yu) 絲(si) 氨酸或蘇氨酸側(ce) 鏈之間形成醚鍵來實現的。

(3)端對端或頭對尾

鏈狀多肽可以在溶劑中環化或通過側(ce) 鏈環化固定在樹脂上。在溶劑中環化應使用低濃度的多肽以避免多肽的寡聚化。頭尾相連合成的環肽的產(chan) 量取決(jue) 於(yu) 鏈肽的序列。因此，在大規模製備環肽之前，應首先創建可能的鏈狀先導肽文庫，然後進行環化，尋找能夠達到最佳結果的序列。

2.N-甲基化

N-甲基化首先出現在天然肽中，並被引入肽合成中以阻止氫鍵的形成，從(cong) 而使肽更能抵抗生物降解和清除。利用N-甲基化氨基酸衍生物合成肽是最重要的方法。此外，N-(2-硝基苯磺酰氯)肽-樹脂中間體(ti) 也可用於(yu) 與(yu) 甲醇的Mitsunobu反應。該方法已用於(yu) 製備含有N-甲基化氨基酸的環肽文庫。

3.磷酸化

磷酸化是自然界最常見的翻譯後修飾之一。在人體(ti) 細胞中，超過30%的蛋白質被磷酸化。磷酸化，特別是可逆磷酸化，在許多細胞過程的控製中發揮著重要作用，例如信號轉導、基因表達、細胞周期和細胞骨架調節以及細胞凋亡。

可以在各種氨基酸殘基上觀察到磷酸化，但最常見的磷酸化目標是絲(si) 氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基。磷酸酪氨酸、磷酸蘇氨酸和磷酸絲(si) 氨酸衍生物可以在合成期間引入到多肽中或者可以在多肽合成之後形成。選擇性磷酸化可以通過使用可以選擇性去除保護基的絲(si) 氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基來實現。一些磷酸化試劑也可以進行後修飾以將磷酸基團引入多肽中。近年來，有學者利用化學選擇性施陶丁格-亞(ya) 磷酸酯反應實現賴氨酸的位點特異性磷酸化。

4.肉豆蔻酰化和棕櫚酰化

N 末端被脂肪酸酰化使得肽或蛋白質能夠與(yu) 細胞膜結合。 N端的肉豆蔻酰化序列可以靶向Src家族的蛋白激酶和逆轉錄酶Gaq蛋白，從(cong) 而與(yu) 細胞膜結合。可以使用標準偶聯反應將肉豆蔻酸連接到樹脂-多肽的N末端，並且可以在標準條件下解離所得脂肽並通過RP-HPLC純化。

5.糖基化

萬(wan) 古黴素和替考拉寧等糖肽是治療耐藥細菌感染的重要抗生素，其他糖肽也常用於(yu) 刺激免疫係統。此外，由於(yu) 許多微生物抗原都被糖基化，因此糖肽的研究對於(yu) 提高感染的治療效果具有重要意義(yi) 。另一方麵，一些研究發現腫瘤細胞細胞膜上的蛋白質表現出異常的糖基化，這使得糖肽在癌症和腫瘤免疫防禦研究中也發揮著重要作用。糖肽的製備一般采用Fmoc/t-Bu法。糖基化殘基，如蘇氨酸和絲(si) 氨酸，通常通過五氟苯酚酯活化的 Fmoc 保護的糖基化氨基酸引入多肽中。

6.異戊二烯化

異戊二烯化發生在靠近C末端的側(ce) 鏈上的半胱氨酸殘基處。蛋白質的異戊二烯化可以增加細胞膜的親(qin) 和力，形成蛋白質-蛋白質相互作用。異戊烯化蛋白包括酪氨酸磷酸酶、小 GTP 酶、共伴侶(lv) 分子、核纖層和著絲(si) 粒結合蛋白。異戊二烯化的多肽可以通過在樹脂上異戊二烯化或通過引入半胱氨酸衍生物來製備。

7.聚乙二醇（PEG）改性

PEG 修飾可用於(yu) 改善蛋白水解穩定性、生物分布和肽溶解度。在多肽上引入PEG鏈可以改善其藥理性質，還可以抑製蛋白水解酶對多肽的水解。 PEG多肽比普通多肽更容易通過腎小球毛細血管橫截麵，大大降低腎髒清除率。

由於(yu) PEG多肽在體(ti) 內(nei) 的有效半衰期延長，因此可以通過使用較低劑量和較低頻率的多肽藥物來維持正常的治療水平。但PEG修飾也有負麵影響。大量的PEG會(hui) 阻止酶降解多肽，但也會(hui) 減少多肽與(yu) 靶受體(ti) 的結合。然而，PEG多肽的低親(qin) 和力通常被其較長的藥代動力學半衰期所抵消。通過在體(ti) 內(nei) 停留更長時間，PEG 多肽更有可能被靶組織吸收。因此，應優(you) 化 PEG 聚合物的規格以獲得最佳結果。另一方麵，由於(yu) 腎髒清除率降低，PEG多肽可在肝髒中積聚並引起大分子綜合征。所以，當肽用於(yu) 藥物測試時，需要更仔細地設計 PEG 修飾。

PEG修飾劑常見的修飾基團可概括如下：氨基（-Amine）-NH2、氨甲基-CH2-NH2、羥基-OH、羧基-COOH、硫氫基（-Thiol）-SH、馬來酰亞(ya) 胺-MAL、琥珀酰亞(ya) 胺碳酸酯- SC、琥珀酰亞(ya) 胺乙酸酯-SCM、琥珀酰亞(ya) 胺丙酸酯-SPA、N-羥基琥珀酰亞(ya) 胺-NHS、丙酸基-CH2CH2COOH、醛基-CHO(如丙醛-ALD、丁醛-butyrALD)、丙烯酸(-Acrylate)-ACRL、疊氮基-疊氮化物、生物素-生物素、熒光素-熒光素、戊二酸-GA、酰肼-酰肼、炔基-炔、對甲苯磺酸鹽-OTs、琥珀酰亞(ya) 胺基琥珀酸鹽-SS等。帶有羧酸的PEG衍生物可以與(yu) N-偶聯。末端胺或賴氨酸側(ce) 鏈。氨基活化的 PEG 可以與(yu) 天冬氨酸或穀氨酸側(ce) 鏈偶聯。MAL激活的PEG可以與(yu) 全脫保護的半胱氨酸側(ce) 鏈的硫醇偶聯[11]。 PEG修飾劑的常見分類如下（注：mPEG為(wei) 甲氧基-PEG、CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH）：

(1)線性PEG修飾劑

mPEG-SC、mPEG-SCM、mPEG-SPA、mPEG-OTs、mPEG-SH、mPEG-ALD、mPEG-丁醇 ALD、mPEG-SS

(2)雙功能PEG修飾劑

HCOO-PEG-COOH、NH2-PEG-NH2、OH-PEG-COOH、OH-PEG-NH2、HCl·NH2-PEG-COOH、MAL-PEG-NHS

( 3)支鏈PEG修飾劑

(mPEG)2-NHS、(mPEG)2-ALD、(mPEG)2-NH2、(mPEG)2-MA7

8.生物素化

生物素可以與(yu) 親(qin) 和素或鏈黴親(qin) 和素強烈結合，結合強度甚至接近共價(jia) 鍵。生物素標記的肽通常用於(yu) 免疫測定、組織細胞化學和基於(yu) 熒光的流式細胞術。標記的抗生物素抗體(ti) 也可用於(yu) 結合生物素化的多肽。生物素標簽通常附著在賴氨酸的側(ce) 鏈或 N 末端。通常使用 6-氨基己酸作為(wei) 肽和生物素之間的連接物。該鏈接可以靈活地與(yu) 基底結合，並且在空間位阻下可以更好地結合。

9.熒光標記

熒光標記可用於(yu) 追蹤活細胞中的肽，以及研究酶和作用機製。色氨酸 (Trp) 具有熒光性，因此可用於(yu) 內(nei) 部標記。色氨酸的發射光譜取決(jue) 於(yu) 周圍環境，並隨著溶劑極性的降低而降低。該特性對於(yu) 檢測肽結構和受體(ti) 結合非常有用。色氨酸熒光可以被質子化的天冬氨酸和穀氨酸猝滅，這可能限製其使用。丹磺酰氯基團（Dansyl）與(yu) 氨基結合時具有高熒光性，也常用於(yu) 氨基酸或蛋白質的熒光標記。

熒光共振能量轉換（FRET）對於(yu) 酶研究非常有用。當使用FRET時，底物肽通常含有熒光標記基團和熒光猝滅基團。標記的熒光團將通過非光子能量轉移被猝滅劑猝滅。當肽與(yu) 所研究的酶解離時，標記基團會(hui) 發出熒光。

10.包層肽

籠形多肽具有光學可去除的保護基團，可以屏蔽多肽與(yu) 受體(ti) 的結合。當受到紫外線照射時，肽將被激活，恢複其與(yu) 受體(ti) 的親(qin) 和力。由於(yu) 這種光學激活可以根據時間、幅度或位置進行控製，因此包合物多肽可用於(yu) 研究細胞中發生的反應。籠形多肽常用的保護基是2-硝基苄基及其衍生物，可以在多肽合成過程中通過受保護的氨基酸衍生物引入。已開發的氨基酸衍生物包括賴氨酸、半胱氨酸、絲(si) 氨酸和酪氨酸。然而，天冬氨酸和穀氨酸衍生物並不常用，因為(wei) 它們(men) 在肽合成和解離過程中容易環化。

11.多聚體抗原肽（MAP）

短肽通常不具有免疫性，必須與(yu) 載體(ti) 蛋白偶聯才能產(chan) 生抗體(ti) 。多聚抗原肽（MAP）由多個(ge) 相同的多肽連接到賴氨酸核心上組成，可以特異性表達高效免疫原，可用於(yu) 製備肽-載體(ti) 蛋白偶聯物。 MAP多肽可以通過在MAP樹脂上固相合成來逐步合成。然而，不全的偶聯會(hui) 導致某些分支上的肽鏈缺失或截斷，從(cong) 而無法顯示原始MAP多肽的特性。作為(wei) 替代方法，可以單獨製備和純化多肽，然後將其偶聯至MAP。連接到肽核心的肽序列清晰，可以通過質譜輕鬆表征。

結論

肽修飾是設計肽的重要方法。化學修飾的肽不僅(jin) 可以保持較高的生物活性，而且可以有效避免免疫原性和毒性的缺點。同時，化學修飾可以賦予肽一些新的優(you) 異性能。 。近年來，利用CH活化的方式對肽進行後期修飾的方法也得到迅速發展，並取得了許多重要成果。