免疫細胞化學故障排除

故障排除

以下故障排除指南旨在解釋免疫細胞化學/免疫熒光 (ICC/IF) 染色中觀察到的常見問題的原因和可能的解決(jue) 方案。

沒信號

抗體(ti) 應用

增加一抗或二抗的濃度或孵育時間。

透化緩衝(chong) 液

• 使用適當的透化試劑進行靶蛋白的定位。 Triton 去汙劑對於(yu) 線粒體(ti) 或核蛋白是必需的，但會(hui) 溶解外膜並破壞正確的膜定位。

• 增加孵育時間或洗滌劑濃度。

細胞固定

• 過度固定可能會(hui) 導致表位掩蔽。減少固定劑的時間或濃度。

抗體(ti) 相容性

• 通過檢查物種反應性來確認您的一抗和二抗是否兼容。

• 確認抗體(ti) 可用於(yu) 蛋白質處於(yu) 天然構象的測定。

• 通過使用陽性對照初級濾光片，確保次級濾光片正常工作並與(yu) 顯微鏡的濾光片組兼容。

目標可用性

• 使用已知表達目的蛋白的過表達測定或陽性對照細胞係。

細胞幹燥

• 如果細胞幹燥，熒光信號將會(hui) 丟(diu) 失。環蓋玻片塗有指甲油。

細胞活力

• 在開始染色程序之前確認細胞活力。

顯微鏡調整

• 增加相機的曝光時間。

背景

抗體(ti) 濃度

• 降低一抗/二抗的濃度。

阻塞

• 增加封閉緩衝(chong) 液中的孵育時間或血清濃度。使用封閉緩衝(chong) 液稀釋一抗和二抗。

抗體(ti) 應用

• 始終將一抗在 4° C 下孵育過夜。室溫孵育會(hui) 增加非特異性結合並導致更高的背景。

• 通過在沒有初級的情況下進行測定，確認次級不會(hui) 與(yu) 細胞發生交叉反應。

汙染文物

• 確保載玻片清潔且無灰塵。緩衝(chong) 液應新鮮配製，以防止微生物汙染。

洗滌

• 增加洗滌次數。對板進行非常溫和的攪拌。

• 增加 PBS-T 中 Tween 的濃度。

光譜重疊

• 如果對細胞進行雙重或三重標記，請確認二級細胞不會(hui) 重疊到相同的光譜範圍內(nei)