雙染法免疫熒光組織化學染色步驟

如果同一標本中需要同時顯示A、B兩(liang) 種抗原，則A抗原的抗體(ti) 用FITC標記，B抗原的抗體(ti) 用TRITC標記，可采用以下染色方法用過的：

免疫熒光細胞化學雙染

原代培養(yang) 的大鼠端腦細胞第14天胚胎：在成骨形態蛋白的誘導下，乙酰膽堿轉移酶（綠色熒光）和同源結構域蛋白Islet-1（紅色熒光）共存於(yu) 細胞質中（激光掃描共存）。聚焦顯微鏡觀察）

1.一步雙染法，將兩(liang) 種熒光標記抗體(ti) 按適當比例（A+B）混合，按照直接法進行染色。

2.兩(liang) 步雙染法，先用TRITC標記的抗體(ti) A進行免疫熒光染色，然後用FITC標記的抗體(ti) B進行免疫熒光染色。根據兩(liang) 種抗體(ti) 的動物種類，可以采用直接法或間接法。結果是A抗原呈橙紅色熒光，而B抗原呈黃綠色熒光。在應用中，常用的方法是免疫熒光組織化學中的間接法與(yu) 熒光染料SABC-Cy3法的結合。例如，在實驗設計中，選擇小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作為(wei) 兩(liang) 種不同的特異性一抗，匹配的二抗分別為(wei) FITC-抗小鼠IgG和生物素化抗兔。免疫球蛋白G。

進行雙染時，由於(yu) 兩(liang) 種一抗來源不同，可能會(hui) 混合一抗。孵育後，清洗未結合的一抗。滴加二抗時，先加入人生物素化抗兔IgG（二抗）孵育。清洗後，滴下 SABC-Cy3 複合物。特異性熒光，然後與(yu) FITC-抗小鼠IgG（二抗）孵育，最後封片觀察。結果，A抗原顯示綠色熒光，B抗原顯示紅色熒光。

該方法中需要注意的是，兩(liang) 種一抗混合稀釋時，抗體(ti) 的終濃度應為(wei) 每種抗體(ti) 的工作濃度。也就是說，混合液要同時滿足兩(liang) 種一抗的工作濃度。如果兩(liang) 個(ge) 一抗來自同一物種，則必須進行兩(liang) 次雙染，即A抗原先用第一個(ge) 一抗和第一個(ge) 熒光二抗染色，然後用第二個(ge) 一抗和第一個(ge) 熒光二抗洗滌熒光二抗。 B抗原染色需使用兩(liang) 種熒光二抗，否則會(hui) 發生交叉反應，導致染色不特異。