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ELISA（酶聯免疫吸附測定）是蛋白質檢測的“金標準"方法。1在本博客中，回顧了三種流行的 ELISA 平台：標準 ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA)。我們(men) 將對這些 ELISA 的設計原理、樣本量、儀(yi) 器和靈敏度進行比較。
ELISA的基本設計原理取決(jue) 於(yu) 抗體(ti) -抗原相互作用的穩定性和特異性。簡而言之，固定在珠子或微孔板等固體(ti) 基質上的捕獲抗體(ti) 可與(yu) 多種樣品類型中的目標蛋白結合。此類樣品可包括血漿、血清、細胞和組織裂解物、條件培養(yang) 基或尿液。
1971 年引入 ELISA 時，酶標記抗原被纖維素顆粒上的抗體(ti) 捕獲。2然後通過反複離心和洗滌分離抗體(ti) -抗原綴合物。此後，不同的 ELISA 格式被開發出來，包括夾心 ELISA，其中目標蛋白“夾在"捕獲抗體(ti) 和標記檢測抗體(ti) 之間（圖 1）。這種 ELISA 格式具有高度特異性，因為(wei) 需要兩(liang) 種抗體(ti) 與(yu) 蛋白質結合才能進行檢測。此外，可以用標準曲線確定蛋白質濃度（即定量數據）。
這裏討論的 ELISA 平台——標準 ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA) ——是生成定量數據的夾心 ELISA。然而，它們(men) 在底物、檢測方法、儀(yi) 器、樣品體(ti) 積和靈敏度方麵有所不同。
標準 ELISA (sELISA) 將捕獲抗體(ti) 固定到透明塑料 96 孔微孔板上（圖 2、表 1）。該檢測抗體(ti) 與(yu) 辣根過氧化物酶 (HRP) 結合，該酶可將其底物 3,3',5,5'-四甲基聯苯胺 (TMB) 還原為(wei) 藍色和氧化形式。顏色的變化與(yu) HRP 的量成正比，並且推論與(yu) 樣品中目標蛋白的量成正比。添加硫酸可終止 HRP-TMB 反應，導致顏色從(cong) 藍色變為(wei) 黃色。使用酶標儀(yi) 在 450 nm 處測量吸光度。
| 標準 | 免疫PCR | SIMOA™ | |
|---|---|---|---|
| 基質 | 96孔微孔板 | 96孔PCR板 | 珠子 |
| 檢測方法 | 比色法 | 聚合酶鏈式反應 | 熒光 |
| 樂器 | 讀板器 | 實時熒光定量PCR儀 | 專用儀器 |
| 樣品量* | 100微升 | 10-25 µL | 125微升 |
| 靈敏度 | 高的 | 更高 | 最高 |
表 1. 標準 ELISA、免疫 PCR 和單分子陣列 (SIMOA) 的比較。 * = 樣品稀釋後每次重複的最終體(ti) 積。
sELISA 的靈敏度一般範圍為(wei) 1 pg/ml 至 100 pg/ml。然而，一些 sELISA 的定量限 (LLOQ) 低至亞(ya) pg/ml 或高達 10 ng/ml。與(yu) 所有 ELISA 一樣，靈敏度取決(jue) 於(yu) 所用抗體(ti) 的靈敏度。
對於(yu) 標準 96 孔板，最終樣品體(ti) 積為(wei) 每孔 100 µL。使用“半麵積"板可以減少體(ti) 積 (50 µL) ，其中孔的直徑為(wei) 一半寬，但測定靈敏度也可能會(hui) 降低。用於(yu) 任何ELISA 的原始樣品體(ti) 積將取決(jue) 於(yu) 最佳樣品稀釋度，該稀釋度會(hui) 因蛋白質、樣品類型和實驗而異。
將樣品添加到板中後，大約 5 小時內(nei) 即可獲得結果。然而，當樣品和抗體(ti) 同時添加到板中時，可以實現更快的周轉時間。這減少了孵育步驟和洗滌步驟的數量。例如，SpeedELISA的處理時間為(wei) 3 小時，在添加樣品之前同時孵育板上的捕獲和檢測抗體(ti) 。其他方法包括一步添加樣品和兩(liang) 種抗體(ti) ，或者將樣品和檢測抗體(ti) 一起添加。然而，減少處理時間會(hui) 降低靈敏度（圖 3）。
sELISA 的主要優(you) 點是提供低成本試劑盒，可以針對來自多個(ge) 物種的數千種不同蛋白質。此外，sELISA 幾乎不需要培訓，可生成易於(yu) 解釋的數據，並使用與(yu) 其他檢測兼容的經濟實惠的酶標儀(yi) 。這些優(you) 點導致 sELISA 在研究中得到廣泛使用。
免疫 PCR也稱為(wei) 免疫定量 ELISA (IQELISA)，將捕獲抗體(ti) 粘附到塑料 96 孔 PCR 板上，同時檢測抗體(ti) 與(yu) DNA 條形碼綴合（圖 4、表 1）。使用 PCR，雙鏈 (ds) DNA 條形碼在條形碼特異性引物和與(yu) dsDNA 結合的熒光染料存在的情況下分別被擴增和染色。熒光與(yu) dsDNA 的量成正比，因此也與(yu) 樣品中目標蛋白的量成正比。使用實時 PCR 儀(yi) 器測量熒光。
IQELISA 的一個(ge) 優(you) 點是其體(ti) 積要求小，每次重複的最終體(ti) 積僅(jin) 為(wei) 10 µL。因此，當樣品量有限或難以獲得樣品時，IQELISA 是一個(ge) 特別有吸引力的選擇。然而，IQELISA 比 sELISA 在技術上更具挑戰性，因為(wei) 它需要更精確的移液。此外，樣品應至少重複三次，因為(wei) 小體(ti) 積會(hui) 增加異常值的機會(hui) 。
DNA 通過 PCR 擴增循環呈指數增長。因此，與(yu) 使用相同抗原和抗體(ti) 對的 sELISA 相比，IQELISA 的 LLOQ 平均增加了 23 倍。靈敏度的增加取決(jue) 於(yu) 抗體(ti) ，範圍從(cong) 無變化到 105 倍（圖 5）。
從(cong) 樣品孵育到數據收集，IQELISA 大約需要 5.5 小時。該周轉時間與(yu) sELISA 類似。
SIMOA是一種超靈敏 ELISA，使用抗體(ti) 包被的珠子和熒光偶聯的檢測抗體(ti) （圖 6、表 1）。將珠子、樣品和檢測抗體(ti) 混合在一起後，將溶液施加到具有超過 235,000 個(ge) 微孔的卡盒中。每個(ge) 微孔隻能容納一顆珠子。然後將油添加到卡盒中，將樣品推過微孔陣列的表麵並形成孔的液密密封。
使用配備熒光顯微鏡的全自動或半自動係統測量熒光；該儀(yi) 器由 SIMOA（ Quanterix ；Billerica，MA；美國）開發商製造。由於(yu) 每個(ge) 孔隻能包含一個(ge) 珠子，因此具有熒光的微孔的數量與(yu) 樣品中目標蛋白的量成正比。這使得單分子檢測成為(wei) 可能。
SIMOA 的一個(ge) 關(guan) 鍵優(you) 勢是它可以檢測飛摩爾範圍內(nei) 的蛋白質。也就是說，靈敏度通常在 10 fg/ml 至 1 pg/ml 範圍內(nei) 。與(yu) sELISA 和 IQELISA 相比，SIMOA 的平均靈敏度分別提高了 465 倍和 63 倍。
將試劑裝入 Quanterix 儀(yi) 器後，大約需要 3 小時才能獲取數據。因此，SIMOA 的程序時間比 sELISA 和 IQELISA 都短。
雖然 SIMOA 實現了此處評測的三個(ge) 平台中的一些最高靈敏度，但該技術也有一些缺點。首先，目前使用該技術分析的蛋白質數量很少（~165）。其次，SIMOA 試劑盒的成本高於(yu) sELISA 和 IQELISA 試劑盒。第三，檢測儀(yi) 器價(jia) 格昂貴，且隻能用於(yu) SIMOA，是專(zhuan) 用儀(yi) 器，需要專(zhuan) 門培訓才能運行。
值得一提的是，IQELISA 和 SIMOA 分別可以同時分析多達 3 個(ge) 和 6 個(ge) 目標。除了需要更少的樣品之外，在分析相同數量的蛋白質時，多重檢測通常比單重檢測更具成本效益。重要的是，多重檢測會(hui) 降低 IQELISA 的靈敏度，而使用SR-X TM生物標誌物檢測係統的SIMOA 則不會(hui) 影響靈敏度。
還提供其他定量多重 ELISA 選項，包括 Quantibody® 和 RayPlex TM 抗體(ti) 陣列。Quantibody可以使用 100 µL 稀釋樣品在 6 小時內(nei) 分析多達 40 種蛋白質，一式四份。使用兼容的激光掃描儀(yi) 采集數據。RayPlex可以使用流式細胞術在 4 小時內(nei) 每次重複使用 25 µL 稀釋樣品測量多達 25 種蛋白質。兩(liang) 種抗體(ti) 陣列的靈敏度與(yu) sELISA 相似。
在我們(men) 的博客“使用抗體(ti) 陣列進行多重蛋白質檢測"或我們(men) 的視頻“為(wei) 您的研究識別正確的抗體(ti) 陣列"中了解如何確定用於(yu) 多重蛋白質檢測的正確抗體(ti) 陣列。
標準 ELISA、免疫 PCR (IQELISA) 和 SIMOA 相互比較時具有優(you) 點和缺點：
sELISA是一種簡單的比色測定法，數據易於(yu) 解釋，因此幾乎不需要培訓。使用能夠測量 450 nm 吸光度的酶標儀(yi) 在 5 小時內(nei) 獲得數據。使用比 IQELISA 和 SIMOA 試劑盒便宜的試劑盒可以靶向數千種不同的蛋白質。然而，與(yu) IQELISA 和 SIMOA 相比，sELISA 的靈敏度低。
免疫PCR使用實時PCR儀(yi) 器，在6小時內(nei) 收集數據。在此介紹的三個(ge) ELISA 平台中，它的體(ti) 積要求低，但比 sELISA 需要更多的移液和數據分析技術專(zhuan) 業(ye) 知識。平均而言，其靈敏度比 sELISA 高 23 倍。可以同時檢測 3 種蛋白質，但檢測靈敏度會(hui) 降低。
SIMOA的靈敏度最高，其靈敏度平均分別比 sELISA 和 IQELISA 提高了 465 倍和 63 倍。使用需要專(zhuan) 門培訓的昂貴專(zhuan) 用儀(yi) 器可在 3 小時內(nei) 獲得數據。它還需要比 sELISA 和 IQELISA 更多的樣本量。一次可以分析多達 6 種蛋白質，而不會(hui) 影響靈敏度。
圖 8 表明，對於(yu) 許多蛋白質，LLOQ 的總體(ti) 改進遵循以下趨勢：SIMOA > IQELISA > sELISA。不過，也有例外。例如，IQELISA 對人 IL-1β 的靈敏度最高，為(wei) 0.0064 pg/ml，而 sELISA 和 SIMOA 的 LLOQ 分別為(wei) 0.3 和 0.04 pg/ml。
最常見的蛋白質檢測工具之一是 ELISA。在這裏，我們(men) 比較了三種流行的夾心 ELISA 平台：標準 ELISA、免疫 PCR和單分子陣列 (SIMOA)。在為(wei) 研究選擇合適的 ELISA 時，其底物、檢測方法、儀(yi) 器、樣品量、靈敏度和成本是重要的考慮因素。標準 ELISA 是流行的方法，因為(wei) 可以使用低成本 試劑盒來靶向來自多個(ge) 物種的數千種不同蛋白質。此外，它幾乎不需要培訓即可運行，其數據易於(yu) 解釋，並且使用非專(zhuan) 用 酶標儀(yi) 與(yu) 其他測定兼容。一個(ge) 關(guan) 鍵要點是 ELISA 靈敏度和成本之間需要權衡：靈敏度越高，成本越高。成本考慮了套件、培訓、勞動力和所需儀(yi) 器的價(jia) 格。因此，sELISA 是實惠的選擇，而 SIMOA 是最敏感的。
對於(yu) 不具備必要的專(zhuan) 業(ye) 知識或設備來使用此處討論的 ELISA 平台分析樣品的實驗室，RayBiotech Life, Inc. 提供完整的測試服務。該服務提供完整的報告，包括原始數據、標準曲線和定量數據。蛋白質濃度。
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