酶法金相學：一種簡單的新染色方法

將有機底物酶促轉化為(wei) 深色、不溶性反應產(chan) 物被廣泛用作免疫組織化學中的檢測方法[1]，並且也已用於(yu) 原位雜交檢測[2]。盡管應用廣泛，但它並不適合所有應用。產(chan) 品的擴散可能會(hui) 限製分辨率，並且染色的連續性可能會(hui) 掩蓋底層的細胞結構。與(yu) 其他細胞染色劑的對比度可能低於(yu) 預期，最近開發的鎳基增強試劑已經解決(jue) 了這個(ge) 問題，該試劑與(yu) 二氨基聯苯胺反應產(chan) 物結合，產(chan) 生較暗的信號[3]。某些應用還需要比直接酶染色更高的靈敏度；這通常是通過聚合酶鏈式反應等擴增方法 [4] 或半抗原化底物（例如生物素化酪胺）的催化沉積來實現的[5]。然而，這大大增加了程序的長度和複雜性，並且還可能受到擴增產(chan) 物的擴散的影響。

我們(men) 發現，在適當的金屬源和活化劑存在的情況下，辣根過氧化物酶綴合的探針可以選擇性地沉積金屬，從(cong) 而產(chan) 生黑色的、高度局部化的染色。圖 1-4 所示結果顯示了新型金相基質與(yu) 傳(chuan) 統 DAB 開發在人類乳腺癌中的比較。將石蠟切片在二甲苯中脫蠟、水合並使用蒸汽熱進行 HIER（抗原修複）30 分鍾。用3% H ₂ O ₂封閉內(nei) 源性過氧化物酶後溶液5分鍾，切片與(yu) 一抗孵育30分鍾，隨後與(yu) Envison檢測試劑盒(Dako Corp)孵育30分鍾。對照（圖 1 和 3）用 DAB 顯色劑染色 5 分鍾，並用蘇木精複染 2 分鍾；實驗切片（圖 2 和 4）用金相基質處理 7-8 分鍾，並用甲基綠複染。與(yu) DAB 相比，染色的點狀性質和非常低的背景結合程度是顯而易見的。該方法還被發現對原位雜交檢測高度敏感（圖 5），並且在平行免疫印跡中產(chan) 生的染色比 DAB 染色深得多（圖 6）。

圖 1 和圖 2：對乳腺浸潤性導管癌進行黃體(ti) 酮受體(ti) （單克隆抗體(ti) PR-88）染色，然後進行 (1) DAB 或 (2) 酶金相分析（條 = 50 微米）。

圖 3 和 4：乳腺導管內(nei) 粉刺癌，使用多克隆 c-erb-B2 一抗對 Her 2/neu 進行染色，然後進行 (3) DAB 或 (4) 酶金相分析（條 = 25 m）。

圖5：中等擴增對照細胞係（4-6個(ge) 拷貝）中Her-2/neu的原位雜交檢測；每個(ge) 點對應於(yu) 該基因的一次出現。使用鏈黴親(qin) 和素、辣根過氧化物酶和金屬沉積混合物檢測的生物素化探針（放大倍數 x 1,000）。

圖 6：（上）使用辣根過氧化物酶的新金相底物開發的免疫印跡。將2微克HRP沉積到硝化纖維素上，用4％BSA封閉，然後用金相基質處理； （底部）使用標準 DAB 開發的相同目標。