藥物抗體(ti) 比 (DAR)和藥物載量或 DAR 分布是 ADC 的兩(liang) 個(ge) 主要關(guan) 鍵特性。 DAR值定義(yi) 為(wei) 與(yu) 抗體(ti) 綴合的藥物分子的平均數量。相反，藥物負載或 DAR 分布定義(yi) 為(wei) 抗體(ti) 載體(ti) 上存在的綴合藥物數量的化學計量分布。 DAR 值決(jue) 定了 ADC 的功效和安全性。高 DAR 可能會(hui) 阻礙 ADC 的藥代動力學特性，而低 DAR 會(hui) 顯著限製這些療法的效力。理想情況下，DAR 分布值應在 2-4 之間。

已經開發了幾種方法來以越來越高的精度測量這些特性。然而，這些係統固有的異質性以及抗體(ti) 載體(ti) 中複雜的翻譯後修飾的存在使得這種表征在分析上具有挑戰性。

目前，這些屬性是使用以下方法測量的：

• 藥物與(yu) 抗體(ti) 的比率（平均DAR）：

• 紫外可見 (UV/Vis) 光譜

• 組織蛋白酶-B酶切法

• 載藥量分布：

• 毛細管電泳（CE）

• 關(guan) 鍵屬性：

• 疏水相互作用色譜 (HIC)

• 反相高效液相色譜（RP-HPLC）

• 質譜（MS）

用於 DAR 測定的紫外-可見 (UV/VIS) 光譜

紫外/可見光譜是用於(yu) ADC 表征的方法。該方法傳(chuan) 統上用於(yu) 確定蛋白質濃度，它依賴於(yu) 測量不同波長 (λ) 下的吸光度。該方法的先決(jue) 條件是：（i）有效負載必須具有紫外/可見發色團； (ii) 抗體(ti) 和有效負載應具有特點的最大吸光度波長（λ最大值，前者通常為(wei) 280 nm）； (iii) 藥物不得幹擾抗體(ti) 的吸收光譜，反之亦然。

如果 ADC 符合所有先決(jue) 條件，則可以根據吸光度值和消光係數計算兩(liang) 種組分的濃度。隨後，平均 DAR 可以簡單地通過將平均藥物濃度除以平均抗體(ti) 濃度來估計。

盡管這種方法通常用於(yu) 估計 ADC 的 DAR，但它存在重要的局限性。例如，ADC 樣品中遊離藥物的存在可能導致 DAR 值的高估。此外，紫外/可見光譜不提供任何有關(guan) 藥物負載分布的信息，而藥物負載分布是一個(ge) 同樣重要的特性。因此，該方法保留用於(yu) 常規質量控製操作，並且在新 ADC 的早期開發過程中很少使用。

用於 DAR 測定的組織蛋白酶 B 酶切法

組織蛋白酶 B 是一種溶酶體(ti) 酶，負責用肽接頭切割 ADC 構建體(ti) 。最近開發了基於(yu) 組織蛋白酶 B 的 DAR 測定酶法。該方法涉及使用多種酶和還原劑進行一係列處理，以允許結合藥物的釋放。隨後通過色譜分離對處理後的遊離藥物進行定量。

ADC 首先用IdeS 蛋白酶預處理，產(chan) 生 F(ab')2 和 Fc 片段，然後用2-巰基乙胺(2-MEA) 還原，以進一步裂解為(wei) Fdʹ、Fc 和 Lc。這種複雜的預處理可確保更好地進入結合位點並更有效地切割有效負載。在這些步驟之後，用組織蛋白酶 B進行消化，然後通過 RP-HPLC-UV 進行蛋白質組分的分離。

由於(yu) 兩(liang) 種組分在藥物定量之前被分離，因此該方法克服了 UV/Vis 方法所施加的最常見限製 -藥物和抗體(ti) 組分需要不同的 λ 最大值。此外，這種方法也被認為(wei) 比質譜法更精確，質譜法的質量信號通常會(hui) 受到疏水性和淨蛋白質電荷的影響，而疏水相互作用色譜 (HIC)在分析隨機綴合的 ADC 時可能會(hui) 受到分辨率效率低的影響。

基於(yu) 組織蛋白酶 B 的方法最重要的限製是無法辨別藥物負載分布。此外，由於(yu) 該方法的複雜性，其用於(yu) 質量控製目的的實施仍然具有挑戰性。因此，該方法在早期開發或抗體(ti) 研究環境中仍然更有用。

用於藥物載量分布測定的毛細管電泳 (CE)

毛細管電泳（CE）具有儀(yi) 器簡單、規格小型化、分離高效快速、進樣量少、分辨率高等特點。已經測試並實施了不同的 CE 方法來表征 ADC，包括毛細管凝膠電泳 (CE-SDS)、毛細管等電聚焦 (cIEF)、成像 cIEF (iCIEF)、毛細管區帶電泳 (CZE) 和毛細管電泳-質譜法 ( CE-MS）。所有這些方法都為(wei) ADC 提供了不同級別的表征，例如異構體(ti) 、乙二醇分析和翻譯後修飾等。

與(yu) 基於(yu) 組織蛋白酶 B 的方法一樣，CE 方法也是最近才開發出來的。因此，很少有文獻可以支持他們(men) 。然而，在這些方法中，iCIEF 始終取得了有希望的結果。該技術允許根據 ADC 電荷變體(ti) 的等電點 (pI) 對其進行分離。通過這種方式，可以有效分離未結合的抗體(ti) 和具有不同載藥量的不同 ADC 種類，有助於(yu) 監測批次間的一致性、載藥量分布和未結合的抗體(ti) 。其缺點是該技術僅(jin) 在基於(yu) 賴氨酸的綴合 ADC 上進行了測試。因此，目前尚不清楚它是否可以應用於(yu) 其他共軛化學。

用於詳細 DAR 分析的疏水相互作用色譜 (HIC)

疏水相互作用色譜 (HIC) 的工作原理是在疏水固定相上運行反鹽梯度。固定相根據樣品成分的疏水性保留和分離樣品成分，並且由於(yu) 該方法使用溫和的條件，因此在分析過程中保留了複雜蛋白質種類的天然構象。因此，HIC 方法可用於(yu) 測量平均 DAR並確定ADC 中的藥物負載分布。

在分析非共價(jia) 蛋白綴合物（例如半胱氨酸連接的 ADC）時，溫和條件的使用使得該技術極其方便。這些綴合物通常在 RPLC（反相液相色譜）等更嚴(yan) 格的色譜方法中解離，使得 HIC 成為(wei) 這些生物藥物詳細 DAR 分析的參考技術。

HIC 技術在分析基於(yu) 賴氨酸和位點特異性的綴合 ADC 時效率相當低。此外，該技術分離未結合分子的能力仍然有限，因為(wei) 這些物質僅(jin) 被部分解析。然而，由於(yu) 最近開發了新的色譜柱和分離方案，HIC 仍然是半胱氨酸連接 ADC藥物載量分布分析的黃金標準。

用於詳細 DAR 分析的反相高效液相色譜 (RP-HPLC)

反相高效液相色譜 (RP-HPLC) 廣泛用於(yu) 表征藥物蛋白質。與(yu) 基於(yu) HIC 的表征相比，RP-HPLC 的優(you) 點是由於(yu) 流動相的揮發性，該方法與(yu) 質譜法的兼容性。相比之下，HIC 使用與(yu) MS 研究不相容的鹽梯度。 RP-HPLC 或簡稱 RPLC（反相液相色譜）作為(wei) 分析平均 DAR、載藥量分布、未綴合抗體(ti) 和遊離藥物接頭種類的方法有著成功的記錄。

對於(yu) 半胱氨酸連接的 ADC，RPLC 是 HIC 的最合適替代品，可用於(yu) 詳細的 DAR 分析。然而，該方法的主要缺點之一源自已知會(hui) 破壞半胱氨酸連接的 ADC 天然構象的惡劣分析條件，通常導致輕鏈和重鏈解離。為(wei) 了克服這一限製，ADC 通常在分析前用還原劑進行預處理。在這種情況下，輕鏈和重鏈更容易分離和單獨評估。或者，ADC 也可以用 IdeS 進行預處理並進行化學還原以生成 Fc、LC 和 Fd 片段。

無論 RPLC 中 ADC 分析所用的方案如何，尋找合適的色譜條件仍然具有挑戰性。對於(yu) 賴氨酸連接的 ADC，RPLC 分離提供的分辨率通常不足以區分具有不同載藥量的完整 DAR 種類。因此，該方法對於(yu) 平均 DAR 測定有效，但在分析賴氨酸連接 ADC 中的藥物負載分布時具有挑戰性。相比之下，位點特異性綴合 ADC 可以通過 HPLC 或基於(yu) HIC 的方法輕鬆分析。

一般來說，獨立於(yu) 綴合化學（半胱氨酸、賴氨酸或位點特異性），RPLC 可以作為(wei) 平均 DAR 質量控製的可靠方法，並且對於(yu) 檢測雜質的存在非常有用。此外，RPLC 方法可用於(yu) 估計 ADC 穩定性並量化遊離藥物分子，使其可用於(yu) 新型 ADC 的廣泛早期表征及其生產(chan) 工藝的優(you) 化。

用於詳細 DAR 分析的質譜 (MS)

質譜 (MS) 分析取決(jue) 於(yu) 分析物的電離效率，並包含多種強大的高分辨率技術。目前用於(yu) 分析大生物分子的 MS 光譜儀(yi) 使用電噴霧電離 (ESI)結合飛行時間 (TOF)或Orbitrap，這有助於(yu) 不同 ADC 物種在還原或非還原條件下獲得高分辨率。

由於(yu) 這些方法的敏感性，通常建議用 PNGase F 預處理 ADC，以消除 N-聚糖引起的異質性，N-聚糖通常會(hui) 掩蓋或幹擾 MS 分析。流行的替代方案包括將 ADC 還原為(wei) 重鏈和輕鏈、抗體(ti) 載體(ti) 的酶促片段化或兩(liang) 者的組合。此外，對於(yu) 通常電離效率特別低的賴氨酸連接的 ADC，研究人員已成功去除有效負載的疏水部分，成功提高了檢測靈敏度。

預處理通常可以對 ADC 進行更詳細的結構分析，包括以高精度和靈敏度檢測低豐(feng) 度 ADC 物種。

結束語

本文涵蓋的所有不同方法都應被視為(wei) 互補的。事實上，使用不同方法獲得的結果的比較有助於(yu) 在平均 DAR、藥物負載分布、未綴合抗體(ti) 含量和遊離有效負載連接體(ti) 含量方麵獲得更準確的 ADC 分子指紋。此外，大多數這些技術的性能和準確性在很大程度上取決(jue) 於(yu) 共軛化學。因此，在早期開發過程中應使用多種方法來確保這些生物藥物的正確和廣泛的表征。

盡管基於(yu) 質譜的方法在分辨率方麵仍然是好的，但將其用於(yu) 常規質量控製通常並不可行。因此，通常應選 HIC 或 CE 等替代方法來加快 ADC 生產(chan) 和質量控製。