Nanogold® 偶聯物分離方法

將凝膠過濾作為(wei) 分離 Nanogold® 結合物的方法：這是我們(men) 實驗室的常規使用方法，並且該方法已得到很好的表征。 Nanogold® 的分子量接近 15,000，但由於(yu) 其中很大一部分是由非常致密的金原子組成的，因此在許多基於(yu) 大小的分離技術（例如凝膠過濾）中，Nanogold 的表現就好像其 MW 更接近大約 8,000。

在計劃您的標記反應時，您應該使用過量的成分，根據尺寸更容易與(yu) Nanogold® 標記的產(chan) 品分離。如果您的分子小於(yu) Nanogold®，您應該使用過量的較小分子進行標記反應（對於(yu) 稍小的分子，大約 5 倍過量是一個(ge) 很好的起點，對於(yu) 小得多的分子，10 倍到 20 倍是一個(ge) 很好的起點分子），因為(wei) 從(cong) 反應混合物中分離過量的小分子比分離過量的大分子更容易。

如果您要標記大於(yu) 約 10,000 MW 的分子，您應該使用過量的 Nanogold®，因為(wei) 現在它比過量的未反應生物分子更容易與(yu) 偶聯物分離。對於(yu) 大多數反應，兩(liang) 倍到五倍的過量是合適的。

凝膠過濾介質及其分離特性的列表在我們(men) 的 偶聯物分離指南.

已經嚐試了其他色譜方法，但迄今為(wei) 止尚未給出可重現的結果。一種對十金有一定成功的方法是疏水相互作用色譜法，這種方法對十®金來說似乎很有希望。該方法的優(you) 點是可用於(yu) 從(cong) 納米金偶聯物中分離較大和較小的雜質;pocedure基於(yu) Hainfeld描述的undecagold，undecagold-Fab'共軛物和unlabelfab'的分離：

應該注意的是，使用的技術是疏水作用色譜，而不是反相;該方法依賴於(yu) 離子強度遞減的梯度，其中不同的固定化分子以不同的離子強度脫落。對於(yu) 十一金和納米金實驗，都使用了丁基衍生化凝膠;還嚐試了聯苯衍生化凝膠，但丁基凝膠給出的結果最好。

使用三到六柱體(ti) 積的梯度進行分離。將偶聯物溶解在2.0 M硫酸銨中，使用乙酸三乙基銨（5 mM）將pH調節至中性值（7或7.5）。用於(yu) 梯度的兩(liang) 個(ge) 緩衝(chong) 區是： （A）2M硫酸銨，使用三乙基乙酸銨（5mM）將pH調節至中性值（6.5，7或7.5）。 （B） 5 mM 三乙基乙酸銨，pH 7 或 7.5。 樣品進樣後，運行一體(ti) 積的緩衝(chong) 液A，然後在梯度上，緩衝(chong) 液B的比例從(cong) 0穩定增加到100%，然後用緩衝(chong) 液B繼續洗脫.使用該梯度，首先洗脫未偶聯的Fab'，然後洗脫Nanogold-Fab'，然後是未連接的Nanogold。

我們(men) 不推薦將凝膠電泳作為(wei) 純化方法，因為(wei) Nanogold® 顆粒在凝膠中的遷移是不可預測的，並且結合物的鑒定並不簡單。透析的結果好壞參半；然而，應謹慎行事，因為(wei) 某些膜含有可降解 Nanogold® 的成分。