熒光壽命的測定

吸收光後，分子在釋放吸收的能量之前保持一定時間的電子激發態。在這裏，不同的光化學過程以不同的概率相互競爭(zheng) 。除了無輻射失活外，還可以發射光，例如以熒光的形式。
之後激發分子數（n1）已降至1/e的係數（約37%），稱為(wei) 熒光壽命（τ佛羅裏達州):

n1（t） = n1（0） e（- t / τ佛羅裏達州)

有機染料的衰減行為(wei) 可以用來識別它。然而，熒光壽命(熒光衰減時間)不是一個(ge) 固定的量，而是受染料所處環境即溶劑和溫度的影響。

ATTO染料 的熒光壽命通常在納秒範圍內(nei) （10 -9秒）。對於(yu) 我們(men) 的目錄，使用下述“時間相關(guan) 單光子計數"方法確定 22 °C 水溶液（PBS，pH 7.4）中羧基衍生物的值。為(wei) 此使用了來自HORIBA Jobin Yvon的使用壽命測量設備TemPro 。


時間相關(guan) 單光子計數 （TCSPC）
激發後熒光光子的發射是一個(ge) 統計過程。因此，單個(ge) 分子保持激發態的持續時間也是一個(ge) 統計量。然而，如果我們(men) 觀察許多相同分子的集合，我們(men) 會(hui) 得到一個(ge) 定義(yi) 明確的衰變統計量。
在當今常用的熒光壽命測量方法TCSPC方法中，這些統計數據的時間分辨非常好 - 低至皮秒範圍（10-12 s） – 並以高檢測靈敏度進行測量。為(wei) 此，用周期性的極短光脈衝(chong) 照射樣品。激發後，樣品發射熒光光子。測量第一個(ge) 光子到達探測器之前的確切時間量。這些單個(ge) 事件被計數，即作為(wei) “計數"輸入直方圖。隨著這種單個(ge) 實驗的非常頻繁的重複，最終通過加計數來獲得樣品衰變曲線的指數過程。

在每個(ge) 激光脈衝(chong) 和計數過程之後，必須重置測量電子設備。在此死區時間內(nei) 無法記錄任何光子。因此，以每 100 個(ge) 激發脈衝(chong) 僅(jin) 檢測到約 1 個(ge) 光子的方式選擇條件。否則，在較高的速率下，直方圖中的短時間會(hui) 被高估並且衰減曲線會(hui) 扭曲（“堆積"）。實際上，測量通常以所謂的“時間反轉"模式進行，即熒光光子開始時間測量，而由另一個(ge) 二極管記錄的激光脈衝(chong) 停止時間測量。

在測量染料樣品之前，應提供有關(guan) 染料的以下信息：

• 吸收和熒光最大值，例如來自溶液或文獻值的吸收和熒光光譜的測量。

• 熒光衰減時間的近似數量級，例如根據以前的測量、可比係統的測量或文獻值估計。

光譜數據決(jue) 定了激發光源的選擇——如今通常使用強激光或半導體(ti) 二極管——以及用於(yu) 發射光譜選擇的截止濾光片的選擇。應選擇此濾光片以防止散射的激發光到達檢測器。

除了選擇合適的激發光源和合適的邊緣濾光片外，還必須遵守其他實驗要求：

• 樣品溶液在激發波長及以上的1cm比色皿中的吸光度應<0.1，以避免重吸收。例如，稀釋溶液還可以防止由聚集和濃度缺失引起的問題。

• 散射樣品溶液會(hui) 導致評估期間意外縮短壽命的“出現"。例如，可以通過μ過濾樣品溶液來避免這種情況。

• 通常，透明液體(ti) 在 1 厘米熒光比色皿中以 90° 排列的方式測量。

• 檢測時間窗口應足夠長（至少 10000 個(ge) 計數）。

在根據TCSPC原理進行熒光壽命測量的情況下，還需要確保計數率不超過脈衝(chong) 激發光源重複率的2%。如上所述，這避免了所謂的“堆積"。

為(wei) 了降低計數率，

• 稀釋供試品溶液。

• 中性玻璃濾光片可以插入激發通道，從(cong) 而降低激發光的強度。

• 可以將波長較長的邊緣濾光片插入發射通道，從(cong) 而減小檢測到的熒光的光譜範圍。

要將計數率提高到 2%，可以應用反向度量。

在測量熒光衰減時間時，還應測量散射溶液.dem例如0.01%Ludox AS40膠體(ti) 二氧化矽溶液，以確定儀(yi) 器功能，即電子器件的響應。這種參考測量的結果可以在以後的數據評估中考慮在內(nei) 。

通過提供的軟件進行數據分析。在這裏，測量的數據點由曲線擬合。熒光衰變曲線的理論過程與(yu) 放射性衰變一樣，對應於(yu) 一階反應，因此是單指數的。但是，它也可能導致更高的指數曲線，以便更好地擬合測量點。例如，在一個(ge) 溶液中存在具有不同熒光壽命的不同物種時，可能就是這種情況。

下圖說明了一批 阿托 488 卡波西與(yu) 天寶裝置。可以識別上述參數，例如檢測時間窗口（峰計數>10000），使用Ludox溶液的參考測量/提示以及樣品的測量。CHISQ = 1.1 且標準差均勻分布的雙指數評估結果證明是最佳擬合的。熒光衰減時間 阿托 488 22 °C 水溶液 （PBS， pH 7.4） 中的羧基為(wei) 4.1 ns，該樣品中的相對比例為(wei) 96.78 %。



軟件中選擇的補償(chang) 曲線的質量以及確定的熒光壽命的正確性等由參數χ2 （CHISQ，XSQ）和加權殘差。
良好的契合度可以通過以下方式識別：

• χ 2 < 1.2 並且在添加另一個(ge) 組件時沒有顯著變化（單指數 -> 雙指數等）

• 加權殘差的均勻分布，標準差

• 與(yu) 以前的測量值或文獻值一致

商業(ye) 設備的供應商提供大量的手冊(ce) 和產(chan) 品文檔，通常詳細描述相關(guan) 設備的正確操作和所提供的軟件。通過遵守給出的說明，例如，測量具有已知熒光衰減時間的染料，您將擁有必要的常規和經驗來測量所用設備的“正確"壽命