可編程宿主反應的糖胺聚糖基水凝膠介紹

1.簡介

三（2-羧乙基）膦（TCEP）和N-（2-氨基乙基）馬來酰亞(ya) 胺三fu乙酸鹽購自 西格瑪-奧爾德裏奇.聚合物水凝膠作為(wei) 瞬時人工細胞外基質（ECM）替代品廣泛用於(yu) 組織工程技術中，以提供機械支持、細胞粘附位點、細胞響應重塑以及營養(yang) 物質和代謝物的運輸[3-5]。基於(yu) 糖胺聚糖（GAG）的聚合物網絡已成為(wei) 一種特別強大的水凝膠變體(ti) ，因為(wei) 它們(men) 允許細胞因子的仿生給藥以指導細胞命運決(jue) 定[6]。為(wei) 了利用由此產(chan) 生的選擇，我們(men) 之前開發了一種基於(yu) GAG的水凝膠的理論驅動設計概念，能夠獨立調節多個(ge) 細胞指導性基質線索[7]： 由多臂（星形）聚乙二醇（星形PEG）和GAG肝素形成的生物雜化水凝膠通過摻入基質金屬蛋白酶敏感（MMP）肽進行交聯，以實現細胞響應性重塑和整合素結合RGD肽以控製細胞粘附[8-12]。改變星形PEG與(yu) 肝素的摩爾比和反應混合物的固體(ti) 含量，為(wei) 在水凝膠生物活性成分的固定濃度下調節交聯度和機械材料性能創造了選擇[7，12-14]。帶高度負電荷的GAG肝素與(yu) 大量不同化學因子和生長因子的非共價(jia) 絡合物相吻合，包括血管內(nei) 皮生長因子（VEGFa），成纖維細胞生長因子2（FGF2）， 基質細胞衍生因子（SDF1α）[10，15–23]。合理設計的星形PEG-GAG水凝膠可以使用不同的交聯反應形成：GAG的羧酸基團和胺封端的星型PEG肽單元之間的同肽鍵可以通過活性酯（碳化二亞(ya) 胺）化學形成[13]。或者，馬來酰亞(ya) 胺官能化的GAG可以用硫醇封端的星型PEG偶聯物使用邁克爾型加成反應方案轉化[12]。後一種方法允許細胞和組織兼容的原位凝膠，因此適用於(yu) 微創植入技術。 GAG的羧酸基團與(yu) 胺封端的星型PEG肽單元之間的同肽鍵可以通過活性酯（碳化二亞(ya) 胺）化學形成[13]。或者，馬來酰亞(ya) 胺官能化的GAG可以用硫醇封端的星型PEG偶聯物使用邁克爾型加成反應方案轉化[12]。後一種方法允許細胞和組織兼容的原位凝膠，因此適用於(yu) 微創植入技術。 GAG的羧酸基團與(yu) 胺封端的星型PEG肽單元之間的同肽鍵可以通過活性酯（碳化二亞(ya) 胺）化學形成[13]。或者，馬來酰亞(ya) 胺官能化的GAG可以用硫醇封端的星型PEG偶聯物使用邁克爾型加成反應方案轉化[12]。後一種方法允許細胞和組織兼容的原位凝膠，因此適用於(yu) 微創植入技術。

雖然以前的體(ti) 內(nei) 研究一直在探索星形PEG-GAG水凝膠的生物醫學應用，包括祖細胞在缺血組織中的積累[10]，慢性皮膚傷(shang) 口的抗炎治療和愈合[24，25]以及帕金森病的新細胞移植策略[20]，但他們(men) 主要關(guan) 注材料的細胞指導特性，沒有研究宿主對植入物的反應。植入後，所有生物材料都會(hui) 不同程度地誘導異物反應，並消除它們(men) 與(yu) 宿主組織的相互作用[26]。 據報道，降解和細胞浸潤速率（作為(wei) 組織重建的第一階段）以及材料的動態變化物理性質及其呈現可溶性介質分子（特別是生長因子）的能力決(jue) 定了植入物的命運[28]。皮下注射時，不含GAG成分的純PEG水凝膠可誘發顯著炎症反應，摻入RGD細胞粘附配體(ti) 可部分減弱炎症反應[29，30]。此外，PEG水凝膠已加載各種類型的生長因子，以促進所需的促再生過程，例如血管形成（VEG Fa）[31]或骨修複（骨形態發生蛋白-2（BMP-2））[27]。然而 到目前為(wei) 止，還沒有研究評估原位組裝星形PEG-GAG水凝膠的異物反應，由於(yu) 摻入的GAG單元作為(wei) 高親(qin) 和力結合位點，可持續地提供生長因子，並允許獨立調整物理網絡特性，粘附性和細胞響應重塑。作為(wei) 細胞外基質的組成部分，GAG在活組織中實現許多不同的功能。它們(men) 創建信號介質庫並調節其功能，在胚胎發生和發育[32，33]，體(ti) 內(nei) 平衡[34]，炎症[35]，腫瘤形成和進展[36]中發揮多方麵作用。提到基於(yu) GAG的細胞指導材料的重要性， 本研究旨在係統地評估宿主對具有不同物理和粘附特性、生物降解特性和促血管生成生長因子功能化的模塊化原位形成starPEG-GAG水凝膠的反應模式。選擇野生型免疫功能正常小鼠（C57BL/6J）皮下植入作為(wei) 代表性模型[37-40]。對皮下植入材料的免疫和血管生成反應通過組織學確定，包括H&E，CD31和CD68染色。通過評估材料的細胞浸潤和鄰近組織的血管化來評估靶組織中水凝膠的整合。報告數據證明了優(you) 異的組織相容性， 建議使用可調原位組裝星形PEG-GAG水凝膠，用於(yu) 安全有效的體(ti) 內(nei) 組織工程應用。

2.材料和方法

2.1.半胱氨酸封端PEG-（MMP）的合成與(yu) 純化4

如前所述，合成了PEG-肽偶聯物（PEG-（MMP）4）[12]。簡而言之，在肽合成器（Activo P14，Activotec）上采用標準Fmoc固相法合成了MMP可切割的Ac-GGPQGIWGQG-GCG-NH2（MMP）肽，並通過分析HPLC色譜法（1100係列;安捷倫(lun) 科技）和 MALDI 質譜（布魯克達爾托尼克有限公司）。接下來，將500mg四臂馬來酰亞(ya) 胺封端的PEG-（馬來酰亞(ya) 胺）4（MW 10000）溶解在5ml水中，並與(yu) 溶解在5ml水中的350mgMMP肽（過量5%）混合。接著，加入5ml磷酸鹽緩衝(chong) 液pH 7.4。通過加入1M NaOH將反應混合物的pH調節至pH 7.5–8。反應在N2氣氛下運行5 h，反應完成後進行HPLC。 為(wei) 了去除StBu保護基團，將摩爾過量（肽）TCEP溶液（pH 7-8）加入反應混合物中，並在室溫下攪拌數小時。接下來，將反應混合物蒸發，溶於(yu) 水中，並通過製備型HPLC純化。從(cong) HPLC收集產(chan) 物，與(yu) 0.1ml 1M HCl混合並冷凍幹燥至少24小時。將所得的白色粉末形式的PEG-肽偶聯物（PEG-（MMP）4）儲(chu) 存在-20°C。1毫升1M HCl並冷凍幹燥至少24小時。將所得的白色粉末形式的PEG-肽偶聯物（PEG-（MMP）4）儲(chu) 存在-20°C。1毫升1M HCl並冷凍幹燥至少24小時。將所得的白色粉末形式的PEG-肽偶聯物（PEG-（MMP）4）儲(chu) 存在-20°C。

2.2.肝素-馬來酰亞(ya) 胺偶聯物的合成純化

所有肝素馬來酰亞(ya) 胺偶聯物均如前所述合成[12，41]。簡而言之，將三倍摩爾過量的EDC和1.5倍摩爾過量的sNHS（指馬來酰亞(ya) 胺）加入溶解在3ml超純水中的0.5g肝素溶液中。將反應混合物在4°C下保持20分鍾。接著，將溶解在超純水中（4°C）中的N-（2-氨基乙基）馬來酰亞(ya) 胺三fu乙酸鹽加入到反應混合物中並在室溫下攪拌過夜。通過透析（分子量截止值為(wei) 8kDa的膜）對1 l的1 M氯化鈉純化3次偶聯物，然後用1 l水透析5次，以除去任何未反應的馬來酰亞(ya) 胺。然後將產(chan) 物冷凍幹燥至少24小時並儲(chu) 存在-20°C。 形成的偶聯物的純度和反應性由HPSEC（1100係列;安捷倫(lun) 科技公司）。
用於(yu) 肽合成的所有溶劑和試劑均購自IRIS Biotech GmbH.Tris（2-羧乙基）膦（TCEP）和N-（2-氨基乙基）馬來酰亞(ya) 胺三fu乙酸鹽購自Sigma-Aldrich。四臂馬來酰亞(ya) 胺封端聚乙二醇（Mn=10.0×103;PDI = 1.06）購自JenKem Technology USA Inc.所有試劑均按原樣使用，未經初步純化。

2.3.水凝膠製備

如前所述製備水凝膠[9]。凝膠製備與(yu) 體(ti) 內(nei) 植入在同一天進行。簡而言之，將10mg肝素 - 馬來酰亞(ya) 胺偶聯物（MW 15000）溶解在107μl磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水（PBS）（生物色素）中。將肝素溶液在冰上冷卻，並以3mM的終濃度加入0.79mg cRGD（國際肽）中。肝素-RGD溶液與(yu) 小鼠重組生長因子（VEG Fa，FGF2或SDF1α;培普羅科技）。每個(ge) 植入物的最終生長因子量是變化的，如表1所示。10mg的PEG-MMP偶聯物（MW 15920）或PEG（MW 15000），溶解在372μlPBS中。肝素-RGD溶液與(yu) PEG或PEG-MMP偶聯液以1∶1的比例輕輕混合， 並將30μl溶液迅速夾在兩(liang) 個(ge) 塗有Sigmacote（Sigma-Aldrich）的5mm玻璃蓋玻片之間。凝膠在室溫下在一分鍾內(nei) 形成。交聯後，除去蓋玻片，留下圓盤狀水凝膠。將每個(ge) 凝膠盤立即浸入400μlPBS中以防止脫水，並儲(chu) 存在4°C直至植入。

2.4.流變學

通過在裝有25 mm平行板幾何形狀的旋轉流變儀(yi) （Ares LN2，TA儀(yi) 器）上進行的膨脹凝膠盤上的振蕩測量來確定水凝膠的存儲(chu) 模量。頻率掃描在25 °C下進行，剪切頻率範圍為(wei) 100-102 rad/s，應變幅度為(wei) 2%。儲(chu) 能模量和損耗模量均作為(wei) 剪切頻率的函數進行測量。由於(yu) 水凝膠的彈性，損耗模量比儲(chu) 能模量低幾個(ge) 數量級，並且低於(yu) 流變儀(yi) 的測量極限。存儲(chu) 模量的平均值是通過至少三個(ge) 獨立實驗計算的，每個(ge) 實驗包括三個(ge) 技術重複。為(wei) 了評估膠原酶降解對儲(chu) 能模量的影響， 在4°C下形成水凝膠，加入1U / mlIV型膠原酶（生物色素），以1Hz掃描，直到沒有進一步增加的剛度。然後將溫度升高至37°C以激活膠原酶，並繼續1Hz掃描直至植入物降解。

2.5.動物和外科手術

所有動物護理和實驗程序均由薩克森州區域辦事處（Landesdirektion Sachsen）動物護理和使用委員會(hui) 以及德累斯頓工業(ye) 大學機構動物護理和使用委員會(hui) （24-9168.11-6/2012-1）批準。將C57BL / 6 J OlaHsd菌株（Harlan Laboratories GmbH）的12周齡雄性小鼠飼養(yang) 在單通風籠中（每籠3-4隻小鼠）。
在手術前，通過腹膜內(nei) 注射lv胺酮100mg / kg和甲苯噻嗪10mg / kg對小鼠進行稱重和麻醉。將動物的背部剃光並用乙醇消毒。通過將水凝膠盤插入皮下的小口袋中並用縫合線閉合皮膚來皮下植入。植入矽盤（矽橡膠MDX4-4210生物醫用級彈性體(ti) ，道康寧）作為(wei) 對照。每隻小鼠在背部的右側(ce) 和左側(ce) 獲得兩(liang) 個(ge) 植入物。兩(liang) 種植入物中的一種含有生長因子。實驗裝置包括每個(ge) 條件八隻小鼠，盡管並非所有水凝膠支架都可以在實驗結束時取回。監測所有小鼠，直到它們(men) 從(cong) 麻醉中恢複。在 7 天或 28 天時， 小鼠通過CO2窒息和頸椎脫位死亡。將植入物和全層真皮組織的相鄰區域一起切除，並立即固定在10%緩衝(chong) 的福爾馬林（Fisher Scientific）中以進行後續分析。

2.6.組織學

對固定的組織樣品進行自動化組織處理，包括在乙醇和二甲苯溶液中逐漸脫水。之後，將樣品嵌入石蠟塊（Paraplast Plus）中，並使用旋轉切片機切割矢狀切片，包括相鄰的修複組織，並使用親(qin) 和素-生物素-過氧化物酶複合物（ABC）技術和二氨基聯苯胺（DAB）底物試劑用CD31和CD68抗體(ti) 染色。此外，所有切片均用蘇木精-伊紅（H&E）染色（細胞核-藍色;細胞質，彈性蛋白和膠原粉紅色）染色。使用自動玻片掃描儀(yi) Axio Scan.Z1和Plan-Aurochromat 20×/0.8 M27（蔡司）觀察和拍攝染色切片。

2.7.圖像分析

使用ImageJ分析圖像。根據表2，從(cong) 盲圖像1到5對水凝膠的降解進行評分。通過反複測量與(yu) 植入物相鄰處形成的囊的寬度來評估異物反應。對血管生成的影響被量化為(wei) 重塑水凝膠內(nei) 肉瘤下方組織或直接相鄰組織中可見的CD31陽性血管。

2.8.統計分析

在所有體(ti) 外實驗中，測試了來自每個(ge) 水凝膠的至少三個(ge) 樣品。數據以平均值±標準差（SD）表示。通過單因素方差分析（ANOVA）進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示。統計分析通過單因素方差分析（ANOVA）進行，如果沒有其他描述。任何小於(yu) 0.05 的 P 值都具有統計學意義(yi) 。

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