ELISA 5種常見問題的解決方案大全

標準品溶液配置有誤

確認是否進行正確稀釋。

標準品複溶不當

開蓋前進行離心；檢查複溶後是否存在不溶物。

標準品已降解

按推薦方式保存和處理標準品。

曲線的標度不適合

嚐試使用不同標度繪製曲線，例如雙對數、5 參數擬合。

移液器加樣誤差

正確使用經過校準的移液器

孵育時間過短

樣品在 4 ℃ 孵育過夜，或遵循試劑的實驗方案。

靶標含量低於(yu) 檢測範圍

減小樣品的稀釋倍數或濃縮樣品。

樣品類型不適用

對於(yu) 沒有驗證過的樣品類型，檢測信號可能減弱或沒有使用驗證過的樣品類型作為(wei) 陽性對照同時進行檢測。

抗原表位被孔板吸附，無法識別

使用直接或間接 ELISA 方法增強檢測肽的能力，將肽偶聯到大的載體(ti) 蛋白上，然後包被到微量滴定板。

檢測緩衝(chong) 液的相容性

確保檢測緩衝(chong) 液與(yu) 靶標兼容（例如，保留酶活性、保留蛋白質相互作用）。

檢測試劑不足

遵循試劑的實驗方案，增加檢測試劑的濃度或用量。

樣品製備不正確

確保進行正確的樣品製備/稀釋。樣品可能與(yu) 微量滴定板測定形式不兼容。

抗體(ti) 不足

嚐試不同的抗體(ti) 濃度/稀釋。

孵育溫度過低

確保在正確溫度下進行孵育。所有試劑（包括孔板）在進行實驗前應處於(yu) 室溫，或試劑的實驗方案所建議的溫度。

波長不正確

確認波長，再次讀板。

孔板被強力洗滌

檢查並確保自動洗滌係統的壓力正確。如果手動洗滌，則輕輕吸取衝(chong) 洗緩衝(chong) 液。

孔變幹

測定開始後，不要讓孔變幹。將所有的孵育步驟使用封口膜或膠帶密封孔板。

酶反應的顯色速度慢

使用前配製底物溶液。確保母液未過期、未汙染。延長孵育時間。

孔中有氣泡

讀板前，確保不存在氣泡。

孔洗滌不均/未充分洗滌

檢查洗板機的所有管口是否暢通。使用推薦方法進行洗滌。

試劑混勻不充分

確保所有試劑充分混勻。

移液量不一致

正確使用經過校準的移液器

邊緣效應

確保孔板和所有試劑處於(yu) 室溫。

樣品製備或保存條件不一致

確保樣品製備保持一致，使用合適樣品保存條件（例如盡可能減少反複凍融）。

孔洗滌不充分

按照實驗方案建議進行洗滌。

洗滌緩衝(chong) 液汙染

製備新鮮的洗滌緩衝(chong) 液。

檢測試劑過多

確保試劑被正確稀釋或者減少檢測試劑的推薦濃度。

封閉緩衝(chong) 液無效（例如檢測試劑結合封閉劑；孔未封閉）

嚐試不同的封閉劑和/或將封閉劑添加到洗滌緩衝(chong) 液。

孵育/洗滌緩衝(chong) 液的鹽濃度

增加鹽濃度可能會(hui) 降低非特異性和/或減弱脫靶相互作用。

讀板前加入終止液後時間太長

添加終止液後立即讀板。

抗體(ti) 出現非特異性結合

使用適當的封閉緩衝(chong) 液，例如 BSA 或 5-10% 正常血清，如果是直標一抗，使用與(yu) 一抗種屬相同的血清，如果是非直標一抗，則使用與(yu) 二抗種屬相同的血清。確保孔已經過預處理，以防止非特異性附著。

高抗體(ti) 濃度

嚐試不同的稀釋度，以獲得好的結果。

底物孵育在光下進行

底物孵育應避光進行，或根據試劑的實驗方案建議進行。

底物加入後孔中有沉澱生成

增大樣品的稀釋倍數或降低底物濃度。

孔板髒

清潔孔板底部。

ELISA 試劑盒保存不當

按推薦方式保存所有試劑。請注意，各試劑的保存條件可能有所不同。

靶標不足

濃縮樣品或降低樣品稀釋度。

檢測試劑失活

確保報告酶/熒光素具有預期的活性。

酶標儀(yi) 設置不正確

在檢測中，確保酶標儀(yi) 設置為(wei) 正確的吸收波長或激發/發射波長。

測定方法不夠靈敏

更換更靈敏的檢測係統（例如從(cong) 比色檢測轉變為(wei) 化學發光/熒光檢測）。更換更靈敏的測定方法（例如從(cong) 直接 ELISA 方法轉變為(wei) 夾心 ELISA 方法）。延長孵育時間或升高溫度。

微量滴定板吸附靶標的效果不佳

將靶標共價(jia) 結合到微量滴定板。

底物不足

加入更多底物。

樣品類型不兼容（例如血清與(yu) 細胞提取物）

對於(yu) 沒有驗證過的樣品種屬，檢測信號可能減弱或沒有。使用驗證過的樣品類型作為(wei) 陽性對照同時進行檢測。

緩衝(chong) 液或樣品成分幹擾

確認試劑中是否存在幹擾性化合物。例如，抗體(ti) 中的die氮化鈉會(hui) 抑製 HRP 酶，在血漿中用作抗凝劑的 EDTA 會(hui) 抑製酶反應。

混合或混用不同試劑盒的試劑

避免混合來自不同試劑盒的試劑。