Nancent蛋白質合成分析

HPG/AHA蛋白合成分析方案熒光顯微鏡

介紹

L-高炔丙基甘氨酸（HPG）和L-疊氮高丙氨酸（AHA）是傳(chuan) 統35S蛋氨酸的非放射性替代品，後者在活性蛋白質合成過程中被並入蛋白質中，可以直接添加到細胞中。用於(yu) 檢測從(cong) 頭合成蛋白的基於(yu) HPG和AHA的商業(ye) 試劑盒提供了很好的結果，但通常非常昂貴，並且提供了固定量的試劑，這限製了這些試劑盒的優(you) 化或非協議使用。自組裝套件是商用套件的可行替代品，尤其是當所有組件都可從(cong) 許多供應商處廣泛獲得時。試劑的量和點擊反應條件在許多商業(ye) 試劑盒之間非常相似，並且符合大量已發表的基於(yu) HPG和AHA的新合成蛋白質檢測程序。使用所提供的方案，研究人員將能夠組裝HPG或AHA蛋白質合成測定，這將需要很少的微調（如果有的話）。

這些具有改進的生物相容性和檢測極限的試劑盒首先由賽默飛世爾科學公司商業(ye) 化，並以Click iT®HPG和Click i T®AHA的價(jia) 格出售。Click Chemistry Tools工具包利用了下一代銅螯合疊氮化物。在疊氮化物報告分子處引入銅螯合部分允許顯著增加反應位點處的有效Cu（I）濃度，增強了反應速率加速中的最弱環節，大大提高了用於(yu) 分析細胞中蛋白質合成的基於(yu) HPG和AHA的測定的靈敏度和生物相容性。

所需材料

HPG（L-炔丙基甘氨酸）或AHA（L-氮雜高丙氨酸）

AZDye吡啶疊氮化物

五水合硫酸銅（II）

THPTA公司

抗壞血酸鈉

固定劑（PBS中3.7%甲醛）

滲透試劑（例如，0.5%Triton®X-100 PBS溶液）

PBS中的3%BSA（pH 7.4）

Hoechst 33342（可選）

材料準備

HPG/AHA儲(chu) 備溶液製備50 mM HPG或AHA在DMSO或水中的溶液，例如使1 mL 50 mM儲(chu) 備溶液溶解8 mg HPG或9 mg AHA在1 mL DMSO中或水中

AZDye Picolyl Azide儲(chu) 備溶液在DMSO或水中製備1mM溶液。示例：要製備150µL，將整個(ge) AZDye Picolyl Azide試劑盒溶於(yu) 150µL DMSO或水中

銅催化劑（25 mM CuSO4，62.5 mM THPTA）溶液稱出312 mg五水合硫酸銅（II）和1.35 g THPTA，加入50 mL水，渦旋至溶解

反應緩衝(chong) 液50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.5。將3.02 g Tris，4.4 g NaCl溶於(yu) 500 mL水中，調節pH至7.5，無菌過濾器

Hoechst 33342 10 mg/mL儲(chu) 備溶液。將1 mg Hoechst 33342溶解在100µL去離子水中

還原劑將20 mg抗壞血酸鈉溶於(yu) 1.8 mL去離子水中。渦旋直至溶解。抗壞血酸鈉溶液易被氧化。我們(men) 建議始終使用新鮮製備的抗壞血酸鈉溶液

在PBS中洗滌緩衝(chong) 液0.5 mM EDTA、2 mM NaN3。向1 L PBS中加入1 mL 0.5 M EDTA和0.13 g幹燥die氮化鈉。用於(yu) 長期儲(chu) 存的無菌過濾器

1.用HPG/AHA標記細胞

該方案基於(yu) 大量基於(yu) HPG和AHA的程序的出版物，用於(yu) 分析與(yu) 不同類型細胞一起使用的細胞中的肽合成。優(you) 化的HPG/AHA濃度為(wei) 50μM，但可能需要根據給定的細胞類型進行調整。生長培養(yang) 基、細胞密度、細胞類型變化和其他因素可能會(hui) 影響標記。鼓勵研究人員首先確定HPG試劑的最佳濃度以及每種細胞類型的標記時間。

將細胞以所需的密度放置在蓋玻片上，並在額外處理前讓其恢複過夜

在DMSO或水中製備50 mM HPG或AHA溶液

用PBS清洗細胞一次，加入無蛋氨酸培養(yang) 基，並在37°C下孵育細胞30–60分鍾，以耗盡蛋氨酸儲(chu) 備

將所需量的HPG或AHA添加到無L-蛋氨酸培養(yang) 基中的細胞中，以達到最佳工作HPG/AHA濃度（50μM，如果未優(you) 化）

在培養(yang) 的細胞中加入HPG或AHA時，避免以可能破壞正常細胞循環模式的方式幹擾細胞

在適合細胞類型的條件下培養(yang) 細胞所需的時間。不同的細胞類型可能需要不同的孵育期，以便用HPG或AHA進行最佳標記。作為(wei) 起點，我們(men) 建議50μM HPG或AHA持續1小時

立即進行細胞固定和滲透

2.細胞固定和滲透

以下方案用於(yu) 在PBS中使用3.7%甲醛的固定步驟，然後進行0.5%Triton®X-100滲透步驟。也可以使用使用其他固定/滲透試劑（如甲醇和皂苷）的方案。

將每個(ge) 蓋玻片轉移到一個(ge) 井中。為(wei) 了方便加工，使用6孔板

代謝標記後，移除培養(yang) 基，向每個(ge) 含有蓋玻片的孔中加入1 mL PBS中的3.7%甲醛。室溫下孵育15分鍾

去除固定劑，用PBS中的1mL 3%BSA清洗每個(ge) 孔中的細胞兩(liang) 次

取出洗滌液。向每個(ge) 孔中加入1 mL 0.5%Triton®X-100 PBS溶液，然後在室溫下孵育20分鍾

3.HPG/AHA檢測

注：每個(ge) 蓋玻片使用500μL反應混合物。隻要剩餘(yu) 的反應組分保持在相同的比例，可以使用較小的體(ti) 積。

根據表1製備所需量的反應雞尾酒。按表中所列順序添加配料。在製備後15分鍾內(nei) 使用反應混合物。

表1

移除滲透緩衝(chong) 液（步驟2.4）。用PBS中的1mL 3%BSA清洗每個(ge) 孔中的細胞兩(liang) 次。取出洗滌液。

向每個(ge) 含有蓋玻片的孔中加入0.5mL反應雞尾酒。短暫搖動盤子，確保反應混合物均勻分布在蓋玻片上。

避光，在室溫下孵育板30分鍾

取出反應混合物。用PBS中的1mL 3%BSA洗滌每個(ge) 孔一次。取出洗滌液。

用1mL洗滌緩衝(chong) 液洗滌每個(ge) 孔一次。取出洗滌液。

用1mL PBS洗滌每個(ge) 孔一次。取出洗滌液。

此時，樣本已準備好進行DNA染色。如果不需要DNA染色，繼續進行成像

如果需要對樣品進行抗體(ti) 標記，請按照製造商的建議進行標記。培養(yang) 過程中，保持樣品免受光照。

4.DNA染色

用1mL PBS清洗每個(ge) 孔。取出洗滌液。

通過稀釋Hoechst 33342 1:2000的儲(chu) 備溶液製備1x Hoechs 33342溶液。1x Hotechst 33332溶液的最終濃度為(wei) 5µg/mL。

1x Hoechst 33342的最終濃度範圍為(wei) 2μg/mL至10μg/mL。

每孔添加1 mL 1x Hoechst 33342溶液。防止光線照射。在室溫下孵育30分鍾。

移除Hoechst 33342溶液。

用1mL PBS洗滌每個(ge) 孔兩(liang) 次。

取出洗滌液。

成像

標記細胞與(yu) 所有載玻片製備方法兼容

所選引用：

Dieterich，D.C.、Link，A.J.、Graumann，J.、Tirrell，D.A.和Schuman，E.M.等人（2006）。使用生物正交非經典氨基酸標記（BONCAT）選擇性鑒定哺乳動物細胞中新合成的蛋白質。美國國家科學院院刊，103（25），9482-87。[PNAS]